結核病（TB）是威脅人類健康的重要傳染病，嚴重威脅著人類的健康。世界衛生組織(WHO) 估算，全球結核潛伏感染人群約17億，占全人群的1/4左右； 2019年報告顯示2018年全球有1000萬新發結核病病例，124萬結核病死亡病例。結核病為全球帶來嚴重威脅與沉重負擔，新藥和更有效疫苗的研發突破迫在眉睫。結核病新藥和疫苗的研發依賴于對其病原菌-結核分枝桿菌的生長發育、分化、毒力及耐藥等相關基因的分子機制的研究。而有效的遺傳操作方法是基因分子機制研究的基礎。然而，由于結核分枝桿菌生長緩慢（大約16-24小時復制一代），同時缺乏有效的重組酶，結核分枝桿菌的遺傳操作方法一直是其研究中的瓶頸，尤其是對單一功能基因的編輯等。雖然現已有許多基因操作工具成功應用于分枝桿菌中，如自殺質粒、條件復制轉運載體、分枝桿菌噬菌體轉導、反向遺傳選擇標記及長片段線性DNA分子，但這些方法存在著費時、低效以及重組效率低等諸多缺點。

孫義成課題組在mBio雜志發表了題為“A CRISPR-assisted non-homologous end-joining strategy for efficient genome editing in Mycobacterium tuberculosis”的論文，研究報道了將CRISPR-Cas系統與非同源末端連接系統（Non-homologous end-joining，NHEJ）偶聯，通過一系列優化實現了在不同種分枝桿菌中進行高效快速的基因編輯。CRISPR-Cas系統能在基因組上匹配位置進行切割形成DNA雙鏈斷裂（Double strand break, DSB），DSB主要通過非同源末端連接（Non-homologous end-joining，NHEJ）和同源重組（Homologous recombination, HR）兩種途徑進行修復。與真核生物修復途徑相比，細菌主要通過HR途徑對BSB修復。分枝桿菌中存在有內源NHEJ途徑，本文通過調控NHEJ與HR的平衡關系：1）高表達NHEJ元件增加NHEJ修復效率；2）抑制RecA介導的HR，進而增加NHEJ修復效率；3）通過誘導啟動表達使CRISPR-Cas介導的DSB發生在菌體生長的穩定期這三方面最終實現了在分枝桿菌中進行快速高效地基因刪除。與此同時，該系統能夠在結核分枝桿菌中進行精確刪除以及同時引入多重基因突變，在進行連續敲除時能夠大大縮短實驗周期。此外，由于該系統高效地編輯效率以及簡化的編輯流程，僅通過一次轉化即獲得到10⁴以上的突變株，因而使得構建突變子庫成為可能，為深入研究結核分枝桿菌基因的功能，進而了解結核分枝桿菌耐藥相關機制提供可靠的技術支持。該研究工作得到了中國醫學科學院醫學與健康科技創新工程等項目的資助。