結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）感染引起的結核病仍然是全球公共衛生的威脅。其中，耐藥結核病（Drug-resistant tuberculosis, DR-TB），尤其是耐多藥結核病（Multidrug-resistant tuberculosis, MDR-TB）仍是全球結核病治療和控制的重大挑戰。2022年世界衛生組織發布的《全球結核病報告》顯示，2021年全球新發結核病例1060萬，其中約45萬例是利福平耐藥結核病（Rifampicin-resistant tuberculosis, RR-TB），全球范圍內DR-TB的治療成功率為60%。因而研發出療效確切、依從性更好的新型抗結核藥迫在眉睫。開發具有獨特作用機制、可與目前使用或處在開發后期的藥物協同作用的新型抗結核藥物是最有效的策略。

2022年11月23日，中國醫學科學院病原生物學研究所孫義成研究團隊、楊劍研究團隊和金奇研究團隊在Science Advances雜志在線發表了題為“Application of combined CRISPR screening for genetic and chemical-genetic interaction profiling in Mycobacterium tuberculosis”的研究論文。首次實現CRISPR敲除文庫在細菌中的構建及應用。利用CRISPR系統構建基因組文庫進行高通量篩選，是目前應用于功能基因組學研究的重要工具之一。CRISPR文庫篩選主要包括敲除（Knockout）和抑制（CRISPRi)等文庫篩選。CRISPRi進行高通量文庫篩選已在原核生物及真核生物中得到大規模運用；而CRISPR敲除（CRISPR-KO）文庫篩選尚未在細菌等原核生物中得到應用。

該研究利用前期構建的基于CRISPR和非同源末端鏈接（Non-homologous End Joining）的分枝桿菌高效基因組編輯技術（Yan, et al., mBio, 2020），在結核分枝桿菌中構建出全基因組CRISPR-KO文庫。利用該CRISPR-KO文庫結合CRISPRi文庫，利用機器學習等生物信息學方法，研究人員分析了結核菌的必需基因，并與已知數據庫進行了比較。研究結果證實了CRISPR-KO文庫篩選的可靠性，同時發現CRISPR-KO和CRISPRi文庫篩選各自具有獨特的優勢和不足，而將它們組合應用將能得到更全面、可靠的篩選結果。隨后，研究人員將CRISPR 組合文庫用于抗結核新藥貝達喹啉(BDQ)的化學-遺傳相互作用（chemical-genetic interaction）的研究，發現了結核菌中幾十個影響貝達喹啉耐藥/敏感性的基因（圖1）。

圖1. CRISPR組合文庫在BDQ殺菌中的篩選結果

為驗證所篩選基因的功能，研究人員通過突變株構建等遺傳技術，驗證了兩個篩選得到的基因topA、lprG影響BDQ殺菌能力；通過藥物協同殺菌實驗等，發現這兩個基因的靶標藥物AMSA、LB04-III確實與BDQ具有協同殺菌作用。最后，根據篩選和驗證結果，研究人員揭示了結核菌相關基因影響BDQ殺菌功效的作用機制（圖2）。

該項研究首次報道了CRISPR-KO文庫在細菌中開展功能基因組學研究。通過對結果的分析發現CRISPR-KO文庫篩選具有靈敏度高的優勢，而CRISPRi文庫的優勢在于其能篩選必需基因。兩種文庫組合進行篩選，可以得到更全面的研究結果。該研究構建的結核菌CRISPR組合文庫，可以廣泛應用于抗結核藥物化學-遺傳相互作用的篩選研究，使研究人員可以更加全面地了解結核分枝桿菌的基因功能及其與抗結核藥物的相互作用網絡，從而有助于新型抗結核藥物的研發。此外，這種CRISPR組合文庫篩選也可以應用于其它細菌的功能基因組學及化學-遺傳相互作用研究。

圖2. 結核菌基因影響BDQ殺菌能力的作用機制

該研究得到了中國醫學科學院醫學與健康科技創新工程（CIFMS2021-I2M-1-043）、科技部重點研發計劃（2020YFA0907202）、國家自然科學基金（82002179）等項目的資助。中國醫學科學院病原生物學研究所孫義成研究員，楊劍研究員和金奇教授為本文的共同通訊作者，孫義成課題組博士后閆玫漪、楊劍課題組助理研究員鄭丹丹以及孫義成課題組博士生李斯尚為本文的共同第一作者。